引言 微量分光光度計的出現解決了微量樣品采用分 光法定性及定量測試的問(wèn)題?；诖颂攸c(diǎn)，該類(lèi)儀 器被廣泛用于生物、醫學(xué)等檢測樣本量并且價(jià) 格昂貴的領(lǐng)域。微量分光光度計屬于分光光度計類(lèi) 測試儀器，遵循朗伯比爾定律，但較普通的分光光 度計還是有很大的改進(jìn)。隨著(zhù)儀器使用量的增多， 不得不考慮該類(lèi)儀器的溯源性問(wèn)題。2015 年相關(guān)部 門(mén)提出并計劃編制該類(lèi)儀器的校準規范，但至今還 未出版正式的國家校準規范。本文針對微量分光光 度計的測試原理和功能特點(diǎn)，分別對兩種校準方式 進(jìn)行了探討，并提出了建議。

 1 微量分光光度計的測試原理及功能特點(diǎn) 微量分光光度計的*之處在于它對測試樣品量 的要求非常低，現有的儀器中可測量低為 0.3 μL 的 樣品，可以節省非常且昂貴的樣品量。檢測波 長(cháng)范圍 200 ～ 1 000 nm，多數儀器設定了定點(diǎn)測試 波 長(cháng) 230 nm、260 nm 和 280 nm， 便 于 DNA、RNA 和蛋白質(zhì)的測試。采用發(fā)光穩定且不需預熱的氙燈 代替鎢燈和氘燈作為光源，壽命更長(cháng)，光強更大。 該類(lèi)儀器中精度稍高的都在使用電感耦合陣列檢測 器（CCD），其光譜范圍、量子效率、信噪比等指標 都遠高于光電二極管陣列。 使用該類(lèi)儀器多用其基座檢測模式，該功能是 實(shí)現微量測試的關(guān)鍵技術(shù)。即，用微量移液槍吸取 樣品滴加在檢測基座上，基座上包埋了一根接受光 纖，放下檢測臂與液體接觸，檢測臂上有檢測光纖， 應用液體的表面張力在檢測基座和檢測臂之間自動(dòng) 形成標準液柱。液柱高度相當于光程，液柱高度可 設定為 0.05 nm、0.1 nm、0.5 nm 等。光源發(fā)出的光與普通的分光光度計相比，從點(diǎn)樣到測試完成 的時(shí)間大大縮短，且省去了清洗比色皿的程序。該 檢測基座只需用拭鏡紙擦拭即可。該類(lèi)儀器可以實(shí) 現的檢測功能如下：普通的紫外 - 可見(jiàn)分光光度計 檢測、DNA/RNA 濃度檢測、蛋白質(zhì)濃度檢測等。

2 微量分光光度計的校準方法分析 通過(guò)查閱資料，現有的微量分光光度計普遍具 有的技術(shù)參數，如表 1 所示。 與普通的分光光度計比較，一些基本的技術(shù)參數還是比較一致的。但是該類(lèi)儀器預設了 DNA、 RNA、蛋白質(zhì)、熒光染料吸光度值與濃度的對應關(guān)系， 所以可以直接給出這些樣品的濃度值。根據以上技 術(shù)參數及測試原理，對微量分光光度計的校準就有 兩種思路， 一是從分光光度計的原理參照普通分光 光度計的檢定規程 JJG 178-2007《紫外、可見(jiàn)、近 紅外分光光度計》來(lái)校準，另一種思路是從該類(lèi)儀 器的測量結果入手，以濃度標準物質(zhì)來(lái)校準其測量 值的示值誤差等。下面對兩種思路做分析對比，并 給出合理建議。 

2.1 以濾光液標準物質(zhì)進(jìn)行校準 該方法可以參照 JJG 178-2007 進(jìn)行部分項目的 校準?？蓪⒉ㄩL(cháng)準確性、波長(cháng)重復性、吸光度準確 性、雜散光等儀器主要關(guān)鍵的技術(shù)指標列為校準項 目。對波長(cháng)準確性和波長(cháng)重復性的校準可以使用現 有的氧化鈥波長(cháng)溶液標準物質(zhì)，該標準溶液在波長(cháng) 240 ～ 650 nm 范圍有 10 個(gè)以上尖銳、峰位明確的吸 收峰。吸光度的準確性可以使用 JJG 178-2007 給出 的方法，配制一定濃度的重鉻酸鉀高氯酸溶液或重 鉻酸鉀硫酸溶液，用高精度的紫外可見(jiàn)風(fēng)光光度計 定值其在 235 nm、257 nm、313 nm、350 nm 處的吸 光度值。通常是在光程為 10 mm 定值，使用時(shí)可根 據朗伯比爾定律 A = - kLc 來(lái)轉換更小光程時(shí)的吸光 度值，當儀器給出的是標準為光程 10 mm 的吸光值 時(shí)則不需要將標準值換算即可進(jìn)行比較。其次要注 意校準時(shí)環(huán)境溫度與定值時(shí)溫度的匹配性。雜散光 特性可以根據 JJG 178-2007 的要求使用 10 g/L 的 溶液和 50 g/L 的亞硝酸鈉分別在 220 nm 和 340 nm 處檢測儀器的透光率或吸光度值。以上校準 方式和項目是基于微量分光光度計的測量原理，結 合生產(chǎn)商給出的技術(shù)參數，使用者可以利用校準結 果對被校儀器有一個(gè)綜合的評價(jià)。此外，如果希望進(jìn)一步了解儀器的基線(xiàn)平直度和基線(xiàn)噪聲等指標也 可參照 JJG 178-2007 來(lái)制定校準方法。 

2.2 以濃度標準物質(zhì)進(jìn)行校準 該方法是在微量分光光度計可以直接測定核酸 和蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的含量值基礎上，以 DNA 標準物 質(zhì)、RNA 標準物質(zhì)或蛋白質(zhì)標準物質(zhì)來(lái)測定標準物 質(zhì)的測量值與標注值之差作為儀器的示值誤差來(lái)評 價(jià)儀器的計量特性。該類(lèi)儀器預設了定點(diǎn)波長(cháng)測試 功能，并且預設了吸光度值與濃度值的關(guān)系。核酸 和蛋白質(zhì)的大吸收波長(cháng) 260 nm、280 nm，為了判 斷核酸或蛋白質(zhì)的純度還增加了 A230 nm 用來(lái)表示 樣品中存在的一些污染物如碳水化合物、苯酚、多 肽等，A320 nm 用來(lái)表示樣品的渾濁度和其他干擾 因子。用濃度標準物質(zhì)來(lái)校準該類(lèi)儀器還可以將測 量值的重復性和儀器的線(xiàn)性納入校準項目，當然儀 器線(xiàn)性的評價(jià)需要用到不同濃度的系列標準溶液。 3 結語(yǔ) 綜合上述分析，種校準方式在稍加細化的 基礎上即可以開(kāi)展校準工作，且對于廣大的計量工 作者來(lái)講比較容易上手，標準物質(zhì)價(jià)格較低且容易 獲得。而后一種校準方式雖然可以給出微量分光光 度計的測量結果的示值誤差、線(xiàn)性等計量特性?xún)?yōu)劣， 但在實(shí)際校準過(guò)程中如何選定標準物質(zhì)，僅單一標 準物質(zhì)還是核酸類(lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)共同使用，因為兩者 是在不同的吸收波長(cháng)下進(jìn)行定量測量，考查的是不 同波長(cháng)下濃度測量的準確性。而且還需要考慮 DNA 或 RNA 標準物質(zhì)及蛋白紙標準物質(zhì)的穩定性、經(jīng) 濟性和易獲得性，且對存儲條件的要求不能太高， 尤其是有些 DNA 含量標準物質(zhì)的存儲溫度要求較 低，不便于計量工作人員進(jìn)行現場(chǎng)校準。所以在 JJG 178-2007 的基礎上研制一套系列標準液，對該類(lèi)儀 器的波長(cháng)準確性、吸光度準確性、雜散光等計量特 性進(jìn)行校準，通過(guò)校準結果可以客觀(guān)、全面地評價(jià) 儀器的技術(shù)指標，給使用者了解該儀器提供更加綜 合的數據。